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RNA总提取液

发表时间:2014-10-23 浏览次数:2327  【关闭

TRIpure试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。无论是人、动物、植物还是细菌组织,该方法对少量的组织(20-100mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1g)和细胞(>107均有较好的分离效果。TRIpure试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIpure抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够满足RNA印迹分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆等各类生物分子学实验需求。

注意事项:
1. 当TRIpure用量少于2ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。
2. 当TRIpure用量较大时,可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管,事先检验以确保该试管可以耐受加入TRIpure和氯仿后12,000×g的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。
3. 离心前小心平衡试管。
4. 离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口,聚丙烯管必须盖紧。
5. 从少量的组织(1~10mg)或细胞(102~104)中分离RNA样品:往组织或细胞中加800µlTRIpure。待样品裂解后,加入氯仿并进行步骤2中的抽提操作。在用异丙醇沉淀RNA之前,加入5~10μg无RNA酶的glycogen作为水样层的载体。为降低其黏度在加入氯仿前用26号注射器抽吸两次以切断基因组DNA。Glycogen会留在水样层中并和RNA共析出。在浓缩到4mg/ml之前它不会抑制逆转录反应第一链的合成也不会抑制PCR。
6. 在匀化后和加入氯仿之前,样品可以在–60~–70°C保存至少一个月。RNA沉淀(步
骤4,RNA漂洗)溶于75%的乙醇在2~8°C至少可以保存一周,在–5~–20°C下至少可保存一年。
7. 台式离心机最大能达到2,600×g的离心力,如果将离心时间延长到30~60分钟可
以满足步骤2和步骤3中的操作。

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